Елизавета отказалась от свидания с Марией и выдвинула условие: та должна очиститься от обвинения в соучастии в убийстве Генри Дарнли. Мария Стюарт после некоторого колебания согласилась. Для расследования дела была создана комиссия из английских пэров. Главным обвинителем был Меррей, а защищал Марию епископ Лесли. Первый суд не нашел достаточного количества улик против королевы. Однако и подозрения с шотландской королевы сняты не были. Елизавета по-прежнему не допускала ее ко двору, но и выпускать из Англии не хотела, опасаясь за свою власть и судьбу протестантизма в стратегически важной для Англии Шотландии.
Практически Мария находилась в заточении, хотя ей и не вынесли обвинительного приговора. Ее переводили из замка в замок, хотя содержали с комфортом. Бывшая королева ела на серебре. Ее покои освещались дорогими свечами. У нее было около пятидесяти слуг. Елизавета ежегодно выдавала на содержание узницы 52 фунта. Ежегодный пенсион в 1200 фунтов присылали из Франции.
Но Мария Стюарт не смирилась. С первых же дней заточения она сумела установить контакты со своими сторонниками в Париже, Мадриде и Шотландии и вела с ними оживленную переписку. Письма прятали в белье, книгах, под подошвами обуви, в крышках футляров с драгоценностями. Однако очень скоро все каналы общения королевы с внешним миром становились известны английскому министру полиции Уолсингему. Друзья Марии все чаще попадали в тюрьму или на плаху.
Пиком интриг Марии стали события 1572 года. Неожиданно судьба дала королеве шанс вырваться из неволи. Ей обещал помочь герцог Норфолк, который возглавлял первый суд над Марией и был одним из крупнейших феодалов в Европе. Очевидно герцог рассчитывал на брак с Марией, что давало ему шанс занять английский трон. Мария ответила согласием. Тогда Норфолк поднял мятеж, его поддержало католическое население. Однако он был разбит и казнен. Эти события в который раз напомнили Елизавете, что Мария Стюарт все так же опасна. Выяснилось, что герцог и Мария вели тайную переписку с Филиппом Испанским.
Последней надеждой Марии оставался ее сын Иаков. Она попыталась наладить с ним связь. Однако молодой король был воспитан врагами своей матери. К тому же Елизавета, испугавшись, что они договорятся, пообещала Иакову английский престол после своей смерти. Между ними был подписан тайный договор, и Иаков окончательно отвернулся от матери. Мария прокляла сына.
Между тем положение Елизаветы на международной арене усугубилось. Против нее выступали все католические государи. Папа Римский отлучил ее от церкви, а в 1580 году объявил, что всякий «убивший Елизавету с благочестивыми намерениями совершит Божье дело». Было раскрыто несколько заговоров, имевших целью устранение Елизаветы. В этой ситуации Мария стала представлять нешуточную угрозу для английской королевы. Католики в Англии пытались сделать ее своим знаменем в борьбе против протестантства и власти Елизаветы.
Режим содержания пленницы был ужесточен. За ее слугами постоянно следили, чтобы лишить их возможности покидать замок и передавать письма на свободу. Любые посылки королевы тщательно досматривались. Марию лишили лошадей. Теперь она не могла совершать прогулки. Но Елизавете и ее министрам и это казалось недостаточным. Было решено устроить ловушку, чтобы обвинить узницу в организации заговора с целью убийства английской королевы.
