Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие - страница 13

Таблица 2. Гликозилазы в клетках человека

Сравнение данных структурного анализа и аминокислотных последовательностей выявляет общие черты для многих ДНК-гликозилаз. У большинства ферментов в активном центре обнаружен один и тот же повторяющийся мотив «спираль-шпилька-спираль» (Helix-hairpin-Helix, HhH). Помимо HhH-мотива в ДНК-связывающих центрах многих ферментов репарации обнаружен остаток консервативного Asp и Pro/Gly богатый район. Механизм узнавания ДНК для всех гликозилаз сходен, и активные центры этих ферментов могут связываться только с «вывернутыми» из спирали ДНК основаниями. Строение одной из гликозилаз (ALKA-1) и способ ее взаимодействия с поврежденным основанием показаны на рис. 5.

На рисунке 5а показано, как ДНК изгибается под углом 66 градусов под влиянием внедрения лейцина-125 и белковых петель αD-αE и αG-αH (показаны более сетлым). Белок заякоревается на ДНК с помощью мотива спираль-шпилька-спираль (HhH), показанного густо-серым. Локальная ось ДНК показана черным.

а

б

Рисунок 5. Схема действия ALKA-1.

а – ALKA-1-индуцированное расщепление ДНК, б – Схематическая диаграмма контакта ALKA-1 с ДНК.

На рисунке 5б видно, что АР-сайт характеризуется вывернутой позицией сахарного остатка, взаимодействующего с аспаргином 238. Лейцин-170 взаимодействует с другой нитью ДНК. HhH работает якорем ДНК на белке.

Несмотря на столь высокое функциональное сходство гликозилаз и их присутствие практически у всех организмов, поиск среди них генов-гомологов пока нельзя признать успешным. Четкая эволюционная линия гомологов найдена только для урацил-ДНК-гликозилазы – гены ung, UNG и hUDG в клетках Е. coli, S. cerevisiae и человека соответственно. Индуцибельная полифункциональная гликозилаза AlkA из Е. сoli (cхема строения которой приведена на рис. 5), репарирующая различные продукты метилирования оснований, оказалась гомологична N-гликозилазе MAG из S. cerevisiae и аналогична гликозилазе MPG из клеток человека. А в клетках S. сerevisiae недавно обнаружен гомолог формамидопиридин-ДНК-гликозилазы Fpg из Е. coli.

Схема процесса BER представлена на рис. 6. После распознавания повреждения гликозилазами и внесения разрыва в сахарофосфатный остов у E.coli в работу вступает еще один фермент – фосфодиэстераза, который отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид, и следующий фермент – ДНК полимераза I вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному З'ОН-концу. Чтобы соединить два свободных конца (З'ОН-конец вставленного нуклеотида и 5'-конец, ранее образовавшийся при разрыве нити ДНК АР-эндонукдеазой), вступает в действие еще один фермент – полинуклеотидлигаза. У человека это соответственно ДНК-полимераза β и лигирующий комплекс лигаза III/белок XRCC1. N-концевой участок этого белка взаимодействует с ДНК-полимеразой β, а С-концевой участок – с ДНК-лигазой III, выполняя структурную функцию. Это один из двух путей BER, при котором брешь в ДНК не превышает 1 нуклеотида. Этот путь носит названия репарации коротткими фрагментами (short path repair). Но есть и другой путь, при котором выщепляется 2-13 нуклеотидов и он носит название репарации длинными фрагментами (long path repair). В этом случае репаративеый синтез ДНК (начиная со второго нуклеотида) осуществляется полимеразами δ или ε, функционирование которых зависит от факторов пролиферации PCNA (proliferaiting сell nuclear antigene) и репликации RFC (replication factor C). Образовавшийся 3’-конец служит мишенью для привлечения RFC, который в свою очередь помогает PCNA связаться с ДНК.