Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие - страница 16

Таким образом, polβ в процессе BER принимает участие и в PCNA-зависимом и в PCNA-независимом (polβ—завимом) путях. PCNA-зависимых путей тоже 2 – в первом из них вставляется 2 нуклеотида, а в другом – около 10–12 нуклеотидов. Может быть, это связано с тем, какая из полимераз – δ или ε будут использованы при этом, но прямых данных об этом нет, так как в системе in vitro замена одной на другую на уровень репарации не влияла.

Установлено, что PCNA может напрямую взаимодействовать с большой субъединицей RFC (состоящего из 5 субъединиц), экзонуклеазой FEN1, ДНК-полимеразой-δ (третья субъединица) и ДНК-лигазой I. Это взаимодействие происходит благодаря наличию во всех этих белках консервативного мотива QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y), содержащего 8 аминокислотных остатков. Наличие этого мотива в различных белках представлено на рис. 7. PCNA служит молекулярным адаптером для привлечения всех этих белков в зону репаративной реакции. Данный мотив был обнаружен и у достаточно большого числа других белков – MSH2, MLH1 (белков, участвующих в эксцизионной репарации неспаренных оснований, MMR), р21, GADD45, циклина D, ДНК-цитозин-5-метил-трансферазы (MCMT), эндонуклеазы XPG. Для р21 опубликовано очень подробное описание его взаимодействия с PCNA, включающее вовлечение в этот процесс вторичной структуры белков.

На той же модели было показано, что эффективность репарации резко падает при использования в экспериментальной системе in vitro мутантных форм FEN1 и лигазы I, у которых не нарушена ферментативная активность, а только поврежден сайт их связывания с PCNA.

Рисунок 7. Белки, имеющие сайт QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y) для связывания с PCNA

Остается неясным, как все эти молекулы с PCNA-связывающим мотивом умудряются связаться с PCNA одновременно – ведь PCNA является гомотримером и может быть одновременно связан по данному мотиву не более, чем с тремя белками, а таких белков описано уже как минимум 15. Можно предположить, что в системе BER PCNA преимущественно связан с ДНК-полимеразой-δ(ε), FEN1 и лигазой I. Связывание же со всеми остальными белками, вероятнее всего, зависит от места и времени протекания реакции, в которую вовлечен PCNА и данные белки.

Тот же самый PCNA-связывающий мотив найден и в двух недавно описанных человеческих гликозилазах UNG2 и MYH1. Главными субстратами для этих гликозилаз служат некорректно встраивающиеся в процессе репликации урацил напротив аденина и аденин напротив 8-оксигуанина соответственно. UNG2 содержит PCNA-связывающий мотив в своей N-концевой части и является основной ДНК-урацил-гликозилазой человека. Напротив, N-конец UNG1, митохондриальной формы урацил-гликозилазы, содержит сигнал, указывающий на ее митохондриальную локализацию, но не PCNA-связывающий мотив. MYH является гомологом MutY E.coli, все ее формы несут PCNA-связывающий мотив в своем С-конце, вне зависимости от наличия у них сигнала митохондриальной локализации.

Предложено два объяснения возможного механизма, при котором эти две гликозилазы связываются с PCNA. Первое – обе эти гликозилазы могут преимущественно привлекать PCNА в район АР-сайта после выщепления неправильного основания, и таким образом направлять реакцию репарации по ее PCNA-зависимой ветви. Вторая возможность состоит в том, что UNG2 и MYH благодаря связыванию с PCNA могут ассоциироваться с «машиной репликации». Недавние исследования показали, что UNG2 может связываться с «машиной репликации» и через PCNA и через RPA (replication protein A, эукариотический гомолог белка SSB прокариот, состоящий из 3 субъединиц). Это больше подходит ко второму объяснению, но не отбрасывает и первого.