Репликация ДНК: учебное пособие - страница 13

Как правило, ДНК-полимеразы α не обладают корректорской 3'—5'-экзонуклеазной активностью. Однако в каталитической субъединице 182 кДа ДНК-полимеразы α дрозофилы обнаружена 3'—5'-экзонуклеаза, проявляющая активность только при диссоциации субъединицы 73 кДа.

Мультибелковая форма ДНК-полимеразы α содержит также белок, который связывает динуклеотид диаденозинтетрафосфат (Ар_>4А). Предполагается, что Ар_>4А участвует в репликации ДНК и клеточном делении. Имеются данные о способности ДНК-полимеразы α использовать Ар_>4А в качестве праймера. Однако участие Ар_>4А в качестве праймера in vivo маловероятно, скорее он используется как эффектор. Интересно, что триптофанил-тРНК-синтетаза, синтезирующая этот динуклеотид, находится в том же мултибелковом комплексе.

Обычно комплекс праймаза-полимераза α состоит из четырех субъединиц: большой субъединицы с молекулярной массой 180 кДа, или семейства полипептидов с размерами от 140 до 160 кДа; субъединицы с молекулярной массой около 68–70 кДа и двух малых субъединиц с молекулярными массами 54–58 и 46–50 кДа. Субъединица р180 отвечает за полимеразную функцию. С двумя малыми субъединицами связана праймазная активность. При этом субъединица 48 кДа является каталитической и непосредственно осуществляет праймирование ДНК, а субъединица 58 кДа участвует в связывании инициирующего пуринового нуклеотида и присоединении субъединицы р48 к ДНК-полимеразе α. Она также влияет на скорость полимеризации и стабильность продукта, синтезируемого субъединицей 48 кДа. р58 также облегчает проникновение р48 из цитоплазмы в ядро. Субъединица р180 непосредственно взаимодействует с р58.

С каталитической субъединицей связана субъединица 68–70 кДа, которая необходима для транспорта каталитического полипептида в клеточное ядро. Субъединица 68–70 кДа участвует также в регуляции уровня ДНК-полимеразы α в клетке, она стимулирует синтез каталитического полипептида. Хотя комплекс ДНК-полимераза α-праймаза состоит из четырех субъединиц, количественный состав этого комплекса может быть различным. Вероятно, полимераза α и праймаза находятся в «коре» в соотношении 1: 3.

Инициация репликации и прерывистый синтез ДНК на отстающей цепи происходит по РНК-праймерному механизму и является универсальным свойством репликации ДНК у про– и эукариот.

ДНК-праймаза отличается от других РНК-полимераз целым рядом присущих только ей свойств. Во-первых, матричной и субстратной специфичностью. Во-вторых, необычной процессивностью – синтезом мультимеров, кратных 10-нуклеотидным звеньям. В-третьих, низкой точностью и устойчивостью к некоторым ингибиторам РНК– и ДНК-полимераз. Здесь необходимо вернуться к проблеме синтеза РНК-праймеров. Синтез РНК-праймеров на природных матрицах начинается во множественных, но не случайных участках, его инициация происходит с АТР или GТР даже при высоких концентрациях СТР и UTР. Показано, что, например, ДНК вируса SV40 содержат предпочтительные участки инициации – 3'-dСТТТ или 3'-dССС, расположенные внутри участков из 7-25 пиримидиновых нуклеотидов. Высокое соотношение АТР/GТР повышает вероятность инициации в участках 3'-dСТТТ, а низкое – в участках 3'-dССС. Таким образом, концентрация NТР и нуклеотидная последовательность матрицы определяют участки инициации. Впрочем, участки инициации in vivo заметно отличаются от участков инициации, используемых во время репликации ДНК SV40. Во многих случаях обнаружена последовательность 5'-YYYYYYYYСТТТYYYY-3', где Y = С или Т, которая является стартовой площадкой для инициации синтеза ДНК-праймазой в составе комплекса с ДНК-полимеразой α. Минимальная длина пиримидинового кластера должна быть не менее 7 н. Замена одного из пиримидинов на 3'-конце кластера значительно понижает частоту инициации, а замены внутри и вне кластера приводят к смещению точки старта. Известно, что матрицу распознает сама ДНК-праймаза. Стартовый нуклеотид вновь синтезированного праймера всегда является пурином (чаще всего – аденином).