Гнойно-септическая инфекция в акушерстве и гинекологии - страница 17

Иммунофлюоресцентный метод.Метод высокочувствителен и специфичен (85 – 90 % и 97 – 99 % соответственно). Основан на взаимодействии антигенов хламидий (ЛПС, МОМР, ОМР-2, ОМР-3, HSP, CRP и др.) со специфическими антителами. Широкий выпуск моноклональных антител налажен в Перми («Биоград») и в Москве («НИАРМЕДИК»). Диагностические наборы зарубежных фирм «Syva», «Micro Track», «Chlamyset» «Orion diagnostic» дороже отечественных, но дают меньше неспецифической флюоресценции.

Материал от больных наносится на предметные стекла или специальные деколированные стекла в пределах ограниченной площадки диаметром 7 – 10 мм вращением тампона или щеточки по стеклу. Высушенный препарат фиксируют холодным ацетоном, абсолютным спиртом в течение 5 – 10 мин. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или хранить при комнатной температуре в течение суток, при температуре 4 C – 5 – 7 дней, при 2 °C – в течение 2 недель.

• При проведении прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) на предметное стекло наносят разведение меченых антител в количестве 25 – 30 мкл. Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 мин. Подсыхание реагента недопустимо. Затем идет отмывка дистиллированной водой или фосфатным буфером (предпочтительно) в течение 20 мин на магнитной мешалке со сменой буфера через 10 мин. На высушенные мазки наносят каплю (25 мкл) забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в люминесцентном микроскопе (объектив 90, окуляры 10, собственное увеличение бинокулярной насадки 1,5). Включения хламидий определяют в цитоплазме эпителиальных клеток по специфической флюоресценции корпускулярных и растворимых антигенов хламидий в виде ярко-зеленого свечения на фоне красной цитоплазмы, так как фон контрастируется синькой Эванса.

• Непрямая иммунофлюоресценция (НИФ) проходит в два этапа. На первом этапе фиксированный мазок обрабатывают антихламидийными антителами (моноклональными гибридомными). На втором этапе используют антимышиные меченые антитела к гибридомным видовым антигенам. Все остальные действия такие же, как при ПИФ.

Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от pH монтирующей жидкости или буфера, используемого при микроскопии. Интенсивность свечения увеличивается в щелочной среде, но при этом увеличивается число объектов с неспецифическим свечением, что ведет к ложноположительным результатам. Сопутствующая микрофлора гениталий, зернистость лейкоцитов, включения гликогена в клетках эпителия, слизь могут давать аутолюминесценцию, что также ведет к ошибкам в диагностике.

Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения в препарате. Результат считается положительным в тех случаях, если препарат содержит клетки эпителия (цилиндрического), не содержит десквамированного эпителия и эритроцитов и определяется более 10 элементарных телец в поле зрения. Отрицательный результат выдается в том случае, когда в препарате отсутствуют элементарные тельца, имеется 10 – 20 интактных клеток цилиндрического эпителия в поле зрения, отсутствуют лейкоциты и эритроциты.

Иммуноферментный анализ(ИФА). Применяют варианты твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов фирм «Syva», «Daco diagn.», «Abbott». Чувствительность ИФА 70 – 90 %. Главное преимущество заключается в объективном учете реакции антиген – антитело с помощью спектрофотометра. Используются антитела к хламидийным антигенам, конъюгированные с ферментами (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и др.). При положительной реакции антиген – антитело, т. е. при наличии в биопробе хламидий, высвобождается фермент, который реагирует на субстрат, специально вводимый в реагирующую смесь, при этом образуется цветное соединение. По интенсивности цвета, регистрируемой с помощью спектрофотометра, судят о наличии и количестве хламидий в материале. Современные аппараты типа Quantum, Multiscan снабжены принтером и дают распечатку полученных результатов. Для постановки реакции требуется в среднем 5 ч. Следует учитывать, что ПИФ, НИФ и ИФА могут давать положительный результат при наличии в пробе нежизнеспособных хламидий, а также (редко) других бактерий, имеющих перекрестно реагирующие антигены.