Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований - страница 49

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Это позволяет выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением в области генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний – геноиндикация. Метод ПЦР позволяет клонировать in vitro определенные участки ДНК, за 2 – 4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа: тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров) и синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при температуре 90 – 95 °C в течение 40 – 50 с. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40 – 65 °C.

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20 – 30 нуклеотидов) – присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой – на противоположной. Синтез (элонгация) – достраивание второй цепи ДНК происходит при температуре 72 °C с участием Taq-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5′-конца к 3′-концу каждой нити ДНК, т. е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет 30 – 40 с. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 21). Обычно ПЦР включает 20 – 30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 21. Схема полимеразной цепной реакции. Сплошной линией показана исходная ДНК, пунктирной – вновь синтезированная

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5 – 3 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.

Метод ПЦР позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 × 10^>1– 1 × 10^>3микроорганизмов в 1 г материала). Он широко применяется для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм и микобактерий).

В лабораторной практике для индикации и идентификации микроорганизмов используют также метод ДНК-зондов, являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Его отличие от последнего заключается в том, что гибридизация ведется не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментами ДНК-зонда (обычно в пределах известного гена) и всей ДНК изучаемого микроорганизма. ДНК-зонды метят изотопами или нерадиоактивной меткой (биотином).