Слабоиммуногенные антигены необходимо вводить со стимуляторами иммуногенеза (адъювантами). Наиболее часто используют адъювант Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон концентраций вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. Однако после введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного.
В ходе первичного иммунного ответа обычно образуются иммуноглобулины класса IgM, продукция которых сменяется синтезом иммуноглобулинов других изотипов. Получаемые описанным выше способом антитела в большей части относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. Однако ответ на некоторые антигены ограничивается синтезом IgM-антител (Haunghton G. [et al.], 1993).
В сывороточных средах содержание антител не превышает 10 % общего количества белка, поэтому для удаления примесных белков и ДНК необходимы высокоэффективные методы очистки. Для очистки антител применяется фракционирование сульфатом аммония. Последующая ионообменная хроматография обеспечивает чистоту антител на уровне только 90 %, поэтому для дальнейшей очистки необходимо использовать дополнительные методы, например гель-фильтрацию. В настоящее время большее распространение получил метод очистки антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или белке G. Этот метод очистки более быстрый (одностадийный) и позволяет получать антитела с чистотой более 95 %.
Моноклональные антитела получают с помощью метода гибридомной технологии. Гибридомы – это клоны – продуценты моноклональных антител. Для их получения лабораторные животные подвергаются иммунизации, затем из их селезенки выделяют иммунные В-лимфоциты (клетки, способные к продукции специфических клонов антител). Их соединяют с клетками миеломы (соматическая гибридизация), которые сами не могут производить специфические антитела, но способны к неограниченному размножению in vitro. После слияния клетки в течение 10 – 14 дней поддерживают в среде. Поскольку не все находящиеся в культуре клетки образованы путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки, которые находятся в среде, делят на линии, которые культивируют в отдельных ячейках. Далее в культуральной среде определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. Отобранные клетки вводят в брюшную полость мышей, где гибридома размножается, подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости). Асцитная жидкость содержит гомогенные моноклональные антитела в высокой концентрации (1 – 10 мг/мл) (Кеннет Р. Г. [и др.], 1983; Альтшулер E. П. [и др.], 2010).
Существуют методы получения антител и без использования лабораторных животных. Один из них основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй представляет собой культивирование клеток в гомогенной суспензии. Затруднения в использовании данных технологий возникают в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител.
