Фиксирующее действие спирта основано, прежде всего, на удалении воды из тканей – обезвоживании. Этот процесс сопровождается коагуляцией белков без существенного нарушения их антигенной структуры. Согласно Б. Ромейсу (1954), в этаноле полностью сохраняется ряд веществ, которые в других жидкостях растворяются целиком или частично. К таким веществам относятся муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций. Напротив, жиры и жироподобные вещества, холестериновые соединения растворяются и экстрагируются. В результате потери воды и липидов цитоплазма сильно сморщивается, причем больше, чем ядро клетки. Несмотря на этот недостаток, фиксация спиртом остается незаменимой для многих специальных исследований.
Обычно этанол промышленного производства, доступный для использования в гистологических целях, соответствует двум категориям:
– ректификат, который представляет собой очищенный перегонкой в производственных условиях 95,5 %-й этанол (96 %-й медицинский спирт);
– абсолютный спирт, получаемый в результате ректификации смеси спирта, воды и бензола. Вначале тройной азеотроп указанных компонентов отгоняется до полного удаления воды, затем азеотроп спирта и бензола – до полного удаления бензола.
Получение из 96 %-го этанола абсолютного спирта в лабораторных условиях весьма затруднительно, поэтому авторы не рекомендуют использовать описанные в литературе методики с прокаливанием медного купороса (из-за низкого качества получаемого спирта) и способы с применением негашеной извести и металлического кальция (из-за высокой пожароопасности). В настоящее время денатурированный абсолютный этанол поставляется многими ведущими фирмами – производителями химических реагентов для лабораторных исследований, его могут приобрести организации, имеющие соответствующую лицензию.
Перед использованием этанола следует убедиться в том, что содержание в нем воды соответствует допустимому уровню для соответствующих методов фиксации и дальнейшей обработки материала. Содержание воды проверяют ареометром (спиртометром). При этом важно соблюдать рабочую температуру, указанную на спиртометре.
Обычно для фиксации употребляется безводный, так называемый абсолютный спирт. Хорошие результаты фиксации удается получить в случае, если толщина объектов не превышает 5 мм. Фиксация идет очень быстро. Для очень тонких кусочков достаточно 15 – 30 мин, при толщине 1 – 2 мм – 0,5 – 1,0 ч, при толщине 3 – 4 мм – 2 – 4 ч. Важно, чтобы препараты лежали на толстом слое ваты в большом количестве спирта, а спирт не разбавлялся проникающей из препарата водой, которая при соблюдении указанных условий будет опускаться на дно. Слой ваты создает условия для равномерной фиксации, благодаря которым спирт проникает в препарат со всех сторон.
Действию абсолютного спирта препарат подвергают в течение времени, необходимого для его полного пропитывания. Длительное воздействие абсолютного этанола чрезмерно уплотняет ткани и делает их хрупкими. Плохо пропитывающиеся объекты (особенно ткани беспозвоночных) Б. Ромейс (1954) рекомендует фиксировать в кипящем абсолютном спирте (2 – 10 мин).
Сразу же после окончания фиксации зафиксированные кусочки лучше пропитать и залить (в парафин, целлоидин либо другие среды). Если нет возможности сразу залить фиксированный препарат, то он переносится в терпинеол или 80 %-й этанол, в которых материал может длительно сохраняться без нарушения способности к окраске и резке (Ромейс Б., 1954).
