1.2.3. Сложные фиксирующие жидкости, содержащие этанол
Сочетание этанола с другими фиксирующими веществами часто используется в научных исследованиях, поскольку позволяет в значительной мере уменьшить отрицательные свойства индивидуальных фиксирующих агентов и ускорить процесс фиксации и последующей проводки, так как в спиртовых растворах одновременно с процессом фиксации начинается обезвоживание тканей.
Сочетание этанола с формальдегидом. Существует несколько вариантов прописи фиксатора, состоящего из этанола и формалина (или параформальдегида). Чаще всего используют 5 – 10 %-й раствор формалина на основе спирта различной крепости (от 70 %-го до абсолютного). Для иммуноцитохимических исследований рекомендуется использовать 1 – 2 %-й раствор формалина (или 0,5 – 0,7 %-й раствор параформальдегида) на 80 %-м этаноле.
Для приготовления 100 мл фиксатора берут 98 мл 80 %-го этанола и 2 мл концентрированного формальдегида. Если используется сухой параформальдегид, фиксатор удобнее готовить следующим образом. Заранее готовится 4,0 %-й водный раствор параформальдегида, который может длительно сохраняться. Для этого параформальдегид растворяют в дистиллированной воде при нагревании (проще всего закрытую емкость оставить в термостате при 37 или 56 °C на 1 – 3 сут, несколько раз перемешивая раствор в течение дня). На каждые 80 мл 96 %-го этанола добавляют по 15 мл полученного водного раствора параформальдегида.
Продолжительность фиксации для иммуноцитохимии – 18 – 24 ч, для обычных окрасок – до 48 ч при комнатной температуре. После фиксации материал в воде не промывают. Обезвоживание можно начинать с 90 – 96 %-го спирта (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
Абсолютный спирт с добавлением ледяной уксусной кислоты (например, 20 мл кислоты на 100 мл спирта) быстро проникает в ткани, так что в нем могут профиксироваться за несколько часов и кусочки несколько более крупные, чем в абсолютном спирте. Способ употребления и результаты сходны с теми, которые характерны при использовании абсолютного спирта. После фиксации материал переносят еще на короткий срок в чистый абсолютный спирт. Затем следует заливка (Ромейс Б., 1954).
Жидкость Карнуа. Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится менее чем за 1 ч до начала фиксации. Фиксатор состоит из абсолютного спирта (можно заменить и 96 %-м), хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях 6: 3: 1. При фиксации в жидкости Карнуа следует вырезать кусочки толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 – 4 ч. Длительное пребывание объектов в фиксаторе в большинстве случаев нежелательно. После жидкости Карнуа материал обезвоживают в абсолютном этаноле, после чего можно сразу приступать к заливке. В случае необходимости после фиксации и обезвоживания материал можно длительно хранить в метилсалицилате (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
Спирт-цинковый фиксатор по Рейману и Унна (1912) состоит из 2 % раствора хлористого цинка в 96 %-м этаноле. Этот фиксатор Б. Ромейс рекомендует для лучшего выявления цитоплазмы клеток.
