Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус - страница 25

На втором этапе проводят расширенный поиск более редких мутаций, используя секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование генома (MPS/NGS).

В ФГБНУ «МГНЦ» (Москва), НИИ медицинской генетики, НИМЦ (Томск), НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и в ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва) на втором этапе используют метод секвенирования по Сэнгеру для выявления мутаций в гене CFTR у пациентов, у которых на первом этапе не были идентифицированы одна, либо обе мутации. Компанией «Парсек Лаб» (Санкт-Петербург) (www.parseq.pro) разработан метод диагностики мутаций гена CFTR на основе высокопроизводительного секвенирования нового поколения. В автоматическом режиме выявляются 319 мутаций, ответственных за развитие клинически значимых проявлений МВ, а также широкий спектр мутаций с неподтвержденным/неизвестным клиническим эффектом (включая мутации de novo). Метод позволяет также обнаруживать крупные делеции/ дупликации гена. Все выявленные методом NGS патогенные варианты гена CFTR подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру [47].

В лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России проводится диагностика методом NGS с использованием технологии таргетного обогащения всех кодирующих, прилегающих интронных, а также 3́- и 5́-нетранслируемых областей гена CFTR. Все выявленные на этом этапе патогенные варианты гена CFTR также подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру.

Третий этап. Обычными сканирующими методами, в том числе секвенированием, можно выявить нарушения последовательности гена, незначительные по протяженности: нуклеотидные замены, небольшие делеции/инсерции. Перестройки, охватывающие несколько экзонов/интронов, такими методами не выявляются. Это можно сделать, используя следующие технологии: MLPA – мультиплексную лигазную зондовую амплификацию либо QFMP – количественную флуоресцентную мультиплексную ПЦР.

К настоящему времени у российских пациентов с МВ выявлены несколько протяженных делеций: CFTRdeleprom.-10, CFTRdele2-8, CFTRdele5-6a, CFTRdele5-10, CFTRdele12-13,16, у нескольких пациентов выявлены делеция CFTRdele6b-10, а также протяженные дупликации: CFTRdup6b-10, CFTRdup23,24, CFTRdupprom-10. Следует учитывать, что, согласно данным Европейского консенсуса по МВ, проведение расширенного молекулярного исследования гена CFTR позволяет выявить мутацию в 98%. Результаты поиска мутаций в гене CFTR у российских пациентов, проведенного в соответствии с представленной стратегией, согласуются с данными Европейского консенсуса [41]. И все-таки остается небольшое число пациентов, у которых одна или даже обе мутации не идентифицированы. Это может быть связано либо с тем, что использованные методы не позволили проанализировать регионы гена, где располагаются мутации, либо с явлением однородительской дисомии, либо с фенокопиями МВ. В таких случаях при проведении сегрегационного анализа сцепленных с геном CFTR ДНК-маркеров можно определить статус носительства определенных гаплотипов членами обследуемой семьи и подтвердить или опровергнуть обусловленность заболевания нарушениями в гене CFTR. Так, выявлены две семьи из Германии, в которых дети с МВ унаследовали от родителей оба гена